医用罗非鱼皮胶原蛋白的制备、性质和修复机理研究

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	医用罗非鱼皮胶原蛋白的制备、性质和修复机理研究
其他题名	tilapia skin collagen Preparation, properties, and repair mechanism of medical
	王蕾
学位类型	博士
导师	秦松
	2022-05-28
培养单位	中国科学院烟台海岸带研究所
学位授予单位	中国科学院大学
学位授予地点	中国科学院烟台海岸带研究所
学位名称	理学博士
学位专业	海洋生物学
关键词	鱼胶原蛋白止血修复人工骨矿化
摘要	鱼胶原蛋白与陆生动物胶原蛋白的氨基酸结构类似,具有良好的水溶性、生物安全性、生物相容性和生物降解性等,易提取、产量高、生产成本低。其生存环境相对洁净,在病毒携带、交叉传染等风险控制方面比陆生动物有明显的优势,被认为是一个重要的医用胶原蛋白替代来源。但目前,鱼胶原蛋白的医学应用尚处于起步阶段,研究主要集中在实验室提取、改性复配、动物体内外功效验证等阶段,尚未出现大规模医用鱼胶原蛋白制备手段,以及明确的应用方向和功效机理方面的数据和理论,研究这些问题可以为鱼胶原蛋白在医用材料领域的应用提供方向和理论支持。因此,本研究首先突破了鱼胶原蛋白的中试快速制备技术,验证了其理化性能、生物学性能、生物安全性和降解性能等。并参照临床致病机理,构建动物模型,对鱼胶原蛋白制备的海绵和人工骨材料,开展了相关质量评价和功效验证。同时,从功效验证结果中,借助组织学、免疫学、分子生物学等方面的技术,对鱼胶原蛋白在软硬组织中的代谢去向和机理进行了初步探索。主要内容如下:(1)以罗非鱼鱼皮为原料,设计建立中试提取工艺,提取鱼胶原蛋白,并进行类型、质量和安全性检测。结果显示,提取的胶原蛋白为高纯度的I型胶原蛋白,提取率达15%。检测显示,获得的鱼胶原蛋白无任何溶血反应和致敏反应,对血细胞和皮肤不会造成任何损伤,具有良好的细胞相容性,无任何免疫排斥反应,生物安全性良好,降解性能良好。初步确认该提取工艺生产的鱼胶原蛋白符合植入类医疗器械的标准。(2)以鱼胶原蛋白为原料制备止血修复海绵材料,通过体内外止血实验验证其止血功效,并对止血机理进行探索。结果显示,鱼胶原蛋白海绵在凝血率、凝血速度、凝血程度、体内凝血等方面表现优异,说明鱼胶原蛋白海绵的凝血性能良好,符合临床对止血材料的要求。电镜结果显示,鱼胶原蛋白肽链上的某些位点可以与血细胞、血小板的特异性位点结合,进而激活外源性凝血途径,在短时间内达到凝血目的。(3)建立大鼠急性创面模型,利用鱼胶原蛋白海绵进行修复,验证其功效的同时,研究鱼胶原蛋白的代谢去向和修复机理。扫描电镜和活/死细胞染色结果显示,鱼胶原蛋白海绵的质地均一、空间结构稳定,孔隙率和孔径便于细胞的黏附、爬行和增殖。植入创面位置后,可促使血管长入创面内部,促进VEGF、FGF等因子的表达,促使创面内部快速完成胶原沉积、组织填充和再上皮化。经过胶原蛋白荧光标记、活体荧光追踪、冰冻切片荧光与I型、III型两种胶原抗体免疫组化的原位对比分析发现,鱼胶原蛋白海绵参与了创面的修复过程,以某种形式成为新生I型和III型胶原的一部分,留在新生组织位置。转录组测序和RT-PCR结果显示,因为鱼胶原蛋白的植入,激发了反馈机制,将信号传递给机体,导致I型、III型两种胶原相关基因的表达水平明显低于自愈个体,反向证明了部分鱼胶原蛋白在创面处被利用,用于I型、III型两种胶原蛋白的合成。(4)构建大鼠糖尿病模型并诱发慢性创面,利用鱼胶原蛋白海绵对慢性创面进行修复,观察治疗效果,同时,再次观察鱼胶原蛋白植入后,I型、III型两种胶原相关基因的表达情况。结果显示,鱼胶原蛋白海绵在慢性创面中表现出与急性创面相同的治疗效果,疗效显著。干细胞搭载实验结果显示,鱼胶原蛋白海绵与大鼠骨髓间充质干细胞可以实现有效搭载,能将干细胞固定在创面位置,使治疗效果显著提升。I型、III型两种胶原蛋白的RT-PCR结果与急性创面相同,在单纯鱼胶原蛋白植入个体和搭载干细胞的鱼胶原蛋白植入个体中都低表达水平。(5)设计反应装置和反应条件,在体外诱导鱼胶原蛋白发生矿化反应,获得鱼胶原蛋白基人工骨材料,对其理化性质、生物学性质、安全性等进行测试,在骨缺损模型中观察其修复效果和去向。通过扫描电镜、机械性能、红外光谱等测试发现,获得的人工骨材料具有与人类松质骨相似的结构和机械强度;细胞毒性、细胞粘附等实验证明其具有良好的细胞相容性,可诱导细胞在其内部爬行和生长;溶血和皮下埋置实验,证实其生物安全性良好,在体内具有良好的生物降解性能。大鼠股骨缺损修复实验结果显示,制备的鱼胶原蛋白基人工骨材料具有一定的诱导成骨能力,在大鼠体内的降解速度基本与大鼠股骨的修复速度相匹配,初步确定该材料可以作为骨修复材料使用。活体荧光实验进一步证实了鱼胶原蛋白作为一种外源的细胞外基质成分,参与了骨修复过程,并成为新生组织的组成部分,与其在皮肤缺损修复过程中的作用类似。根据上述研究结果可以得出以下结论:在保持低温的状态下,使用反应釜和膜过滤设备可以实现鱼胶原蛋白的快速提取、分离纯化、除菌等,由此方法提取的鱼胶原蛋白基本符合植入类医用I型胶原蛋白的质量标准。该鱼胶原蛋白与陆生动物胶原同样具有矿化位点,可以实现体外矿化,获得的人工骨材料在理化性质、生物学性质、生物相容性、降解性等方面表现优异。由鱼胶原蛋白制备的海绵具有良好的体内外止血功效、急慢性创面修复效果;矿化制备的鱼胶原蛋白基人工骨材料具有良好的诱导骨再生、骨修复能力。通过探索,初步确定鱼胶原蛋白可以与血小板、血细胞特异性位点结合,诱发血液的凝集,促进物理性止血反应的发生。初步判断鱼胶原蛋白在创面位置和骨缺损部位可能以某种形式被利用,成为新生胶原结构的一部分,再通过反向调节机制反馈给机体,使得机体减少I型和III型胶原相关基因的表达。该结论为鱼胶原蛋白原料、衍生产品等相关标准的制定,以及鱼胶原蛋白的应用方向提供了一定的数据支持,对深入研究外源性胶原蛋白在机体的代谢和作用机理提供了一定的参考。还原
页数	155
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.yic.ac.cn/handle/133337/34385
专题	海岸带生物学与生物资源利用重点实验室_海岸带生物学与生物资源保护实验室海岸带生物学与生物资源利用重点实验室
推荐引用方式 GB/T 7714	王蕾. 医用罗非鱼皮胶原蛋白的制备、性质和修复机理研究[D]. 中国科学院烟台海岸带研究所. 中国科学院大学,2022.

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医用罗非鱼皮胶原蛋白的制备、性质和修复机（9813KB）	学位论文		开放获取	CC BY-NC-SA	请求全文