海岸带生物学与生物资源保护实验室知识库

   滨海盐碱地具有优势的水热条件，是盐碱地开发利用中的重点区域，有效改良和利用这类土地对滨海区域的经济发展和生态建设具有深远意义。种植耐盐植物能够改善滨海盐碱地的土壤结构和微生物活性，从根本上改良盐碱土。根瘤菌-豆科植物共生体系作为一类重要的生物改良体系，深入研究其共生机制能够为滨海盐碱地的生物改良模式提供重要的理论依据。

   田菁是一种豆科植物，具有耐盐耐涝等特性，是改良滨海盐碱地的先锋植物。茎瘤固氮根瘤菌作为一类特殊的根瘤菌，不仅能够与宿主田菁建立共生体系固氮，还能够在自生状态下进行固氮。c-di-GMP是细菌中广泛存在的第二信使，能够调控细菌的多种生理功能，包括运动能力，胞外多糖的合成，细菌毒力等。茎瘤固氮根瘤菌和宿主田菁共生体系建立的过程涉及根瘤菌的运动趋化能力、宿主根系定殖能力及抵抗结瘤过程中活性氧的能力等，c-di-GMP作为重要的第二信使在这一过程中的作用缺乏深入研究。本论文以茎瘤固氮根瘤菌ORS571为研究对象，对其c-di-GMP信号途径相关基因进行了研究，取得如下研究结果：

   利用生物信息学的方法系统分析了茎瘤固氮根瘤菌ORS571基因组中c-di-GMP代谢相关基因，共发现37个编码GGDEF/EAL结构域的基因。选取了同时编码GGDEF和EAL结构域的基因AZC_3085，AZC_3226，AZC_4658进行了功能鉴定。其中，AZC_4658的缺失突变体表现出运动能力降低，胞外多糖合成量提高，生物膜产量提高，竞争性结瘤能力提高等表型，并且AZC_4658的缺失导致胞内c-di-GMP水平提高。研究结果表明茎瘤固氮根瘤菌ORS571基因组中具有数目众多的c-di-GMP代谢基因，可能具有复杂的c-di-GMP代谢网络，并且c-di-GMP的部分代谢基因的功能是冗余的。

   鉴定了由基因AZC_0308编码的磷酸二酯酶Chp1。Chp1同时具有GGDEF和EAL结构域，还具有PAS调控结构域。酶活检测表明Chp1只具有磷酸二酯酶的活性；Chp1的PAS结构域能够结合heme并对Chp1的磷酸二酯酶活性起到调控作用。∆chp1突变体与野生型相比，胞内c-di-GMP水平提高，胞外多糖产量提高。实时定量PCR结果表明∆chp1突变体中胞外多糖合成相关基因的表达水平提高，说明c-di-GMP在转录阶段调控了胞外多糖的合成。构建了胞外多糖合成基因缺失突变株，过氧化氢敏感性实验表明茎瘤固氮根瘤菌ORS571的胞外多糖能够抵抗过氧化氢的致死作用。∆chp1突变体对宿主田菁根系的竞争性吸附能力提高，竞争性结瘤能力也有提高，但是最终的共生固氮活性没有受到影响。综合分析，c-di-GMP调控的胞外多糖合成在促进根系吸附和抵抗结瘤过程中的过氧化氢中都起到非常重要的作用。

   鉴定了由基因AZC_3349编码的c-di-GMP受体Cbp1。Cbp1能够结合c-di-GMP，并且结合c-di-GMP之后其蛋白构象会发生变化，关键氨基酸Arg320的突变导致Cbp1完全失去结合c-di-GMP的能力。作为趋化受体，Cbp1的缺失导致ORS571趋化能力降低，回补实验进一步证明了Cbp1结合c-di-GMP的能力对其介导的趋化作用是必需的。∆cbp1突变体趋化能力的受损导致其对宿主田菁的竞争性根系吸附能力降低，并且竞争性结瘤能力也降低。结果表明，c-di-GMP信号通路能够与细菌趋化系统互作，共同影响茎瘤固氮根瘤菌-田菁共生体系的建立。基因AZC_1615和AZC_1616编码的两个单独PilZ结构域蛋白能够在调控茎瘤固氮根瘤菌ORS571的运动能力方面起到相反的作用，具体调控机理正在进一步的研究中。

   本论文对茎瘤固氮根瘤菌ORS571的c-di-GMP信号途径进行了系统研究，鉴定了一个c-di-GMP的降解酶和一个c-di-GMP的受体，揭示了c-di-GMP能够通过不同的作用机制来影响茎瘤固氮根瘤菌ORS571与宿主田菁的共生，为深入理解复杂的c-di-GMP信号途径和茎瘤固氮根瘤菌-田菁共生体系建立提供了理论依据。